奥斯曼土耳其人在1453年征服君士坦丁堡，苏丹穆罕默德二世下令将大教堂转变为清真寺，还将钟铃、祭坛、圣幛、祭典用的器皿移去，用灰泥覆盖基督教镶嵌画。日后又逐渐加上了一些***建筑，如米哈拉布、敏拜尔及外面的四座叫拜楼。
大教堂藏有大量圣物，当中以一个15米（49英尺）高的银圣幛最具特色，圣索菲亚大教堂是君士坦丁堡牧首的圣座，在将近千年的时间里都是正教会的焦点。1054年，枢机穆瓦延穆捷的亨伯特（HumbertofMourmoutiers）到圣索菲亚大教堂的祭坛将牧首米恰尔一世·色路拉里乌（MichaelICerularius）逐出教会，该事件被视为东西教会分裂的开端。
随着土耳其共和国的建立，1934年该教堂失去了其宗教意义。1935年2月1日，这座建筑重新以博物馆的身份对世人开放。
作为接近500年来伊斯坦布尔最重要的清真寺，圣索菲亚大教堂是众多奥斯曼帝国时期清真寺如苏丹艾哈迈德清真寺（蓝色清真寺）、塞札特清真寺（?ehzadeMosque）、苏莱曼尼耶清真寺、鲁斯坦帕夏清真寺（RüstemPashaMosque）、奇力克阿里帕夏清真寺（K?l??AliPa?aMosque）的模范。由君士坦丁大帝为供奉智慧之神索非亚，始建于公元325年，后受损于战乱，公元537年查士丁尼皇帝为标榜自己的文治武功进行重建，它作为基督教的宫廷教堂，持续了9个世纪。
公元7世纪之后，阿拉伯半岛上出现新兴势力***文明，接着十字军东征来到君士坦丁堡，但此时统治者已无力阻止联军与战争对城市的蹂躏。接着是土耳其人登场，东罗马帝国正式宣告结束。公元1453年，奥斯曼土耳其将君士坦丁堡改名为伊斯坦堡，并将索菲亚大教堂改成阿雅索菲亚清真寺。
公元1453年6月，奥斯曼土耳其苏丹穆罕默德攻入了君士坦丁堡，他下令将教堂内所有拜占庭的壁画全部用灰浆遮盖住，所有基督教雕像也被搬出，并将大教堂改为清真寺，还在周围修建了4个高大的尖塔。查士丁尼一世选用物理学家米利都的伊西多尔和数学家特拉勒斯的安提莫斯为建筑师，但安提莫斯在不足一年内逝世。
拜占庭史学家普罗科匹厄斯在《建筑》一书里描述了建造圣索菲亚大教堂的状况。皇帝将帝国各地的物料运送到君士坦丁堡，如以弗所阿耳忒弥斯神庙的古希腊圆柱。大石都是来自远处的采石场，包括埃及的斑岩、色萨利的绿色大理石、博斯普鲁斯海峡地区的黑石及叙利亚的黄石。
超过一万人参与建造工作，这所新教堂马上就被认为是重要的建筑，展示了建筑师的创造力。建筑师们采用了希罗的理论，在广大的空间之上建造巨大的圆顶。皇帝与牧首梅纳斯在537年12月27日一起参与了盛大的落成仪式。教堂内的镶嵌画则在查斯丁二世在位时（565年－578年）才完成。
553年8月及557年12月的地震使主圆顶及东面的半圆顶破裂，558年5月7日发生的地震使主圆顶彻底倒塌，破坏了读经台、祭坛及其华盖。皇帝马上下令修复，让米利都的伊西多尔的侄甥伊西多拉负责修复工作。他使用了较轻巧的物料，又将圆顶提高了6.25米（20.5英尺），使教堂的内部高度达到现时的55.6米（182英尺）。
修复工程在562年完成，使教堂在6世纪的面貌得以保存至今。拜占庭诗人示默者保罗（PaultheSilentiary）为教堂的重建创作了一首名为《读画诗》的长诗。562年12月23日，牧首优迪基乌（Eutychius）主持落成仪式。
圣索菲亚大教堂是君士坦丁堡牧首的座堂，并且是拜占庭帝王仪式的首要场地，如加冕典礼。大教堂为作恶者提供庇护，外国游客对此深受感动。
726年，拜占庭皇帝利奥三世颁布一系列的诏令抵制偶像崇拜，命令军队摧毁一切圣像，迎来了毁坏圣像运动。圣索菲亚大教堂内的所有宗教画像及雕像被移除。在伊琳娜女皇执政时期（797年－802年），圣像崇拜得到短暂的恢复，此后偶像破坏者卷土重来。拜占庭皇帝狄奥斐洛（Theophilus）深受***艺术影响，而***艺术是禁止偶像崇拜的。他将刻有画押字的青铜两翼门安装在大教堂的南面入口。
859年的大火对大教堂造成破坏，而869年1月8日的地震使一个半圆顶倒塌，巴西尔一世下令复修。
989年10月25日发生强烈地震，破坏了大教堂的大圆顶，巴西尔二世委托阿美尼亚建筑师、阿尼及阿吉涅大教堂的创造者梯利达特（Trdat）修复圆顶，西面的圆拱及部份大圆顶是他主要的修复部分。大教堂的损毁程度使修复工作持续了六年，大教堂在994年5月13日重开。
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